siRNA双链稳定性常用熔解温度（Tm）衡量。即双链中有一半解离为互补单链或一半二级结构线性化时的温度,Tm越高，核酸双链或二级结构越稳定。

在液相色谱分析中，变性条件（高于Tm）常用于确保寡核苷酸的可预测保留行为，避免分子内和分子间相互作用干扰；而非变性条件则适用于特定分析需求，如双链限制性片段的尺寸测定和siRNA双链中单个链成分的量化分析，可避免单链峰的假阳性检测。

目前，siRNA双链的Tm可通过在线计算器预测，但这些计算器仅适用于水溶液和有限缓冲液体系，无法考虑离子对缓冲液和有机改性剂等色谱常用试剂对Tm的影响。同时，液相色谱分离条件（流动相组成、固定相类型等）对siRNA双链稳定性的系统影响尚未明确，这给色谱方法开发带来挑战。

图1. 本研究中使用的siRNA双链序列

♦ 阳离子浓度：浓度越高，双链越稳定

• 阳离子（以Na+为例）浓度升高会显著提升siRNA双链Tm，在磷酸钠缓冲液中，[Na+]浓度从10 mM 增至 25 mM、100 mM 时，DSC 测得的Tm分别从67.1℃升至74.8℃、87.2℃。 

• 高浓度阳离子通过增强对核酸链负电荷的中和作用，减少链间排斥，从而稳定双链结构。

图2. 在10、25和100 mM [Na+]浓度下获得的DSC熔解曲线

• 烷基胺类阳离子（如TEA+、HA+）因体积大、电荷中和能力弱，对双链的稳定作用显著弱于碱金属阳离子（如Li+、Na+）。

♦ 有机变性剂：降低双链稳定性，变性能力有差异

变性效果：向缓冲液中添加 20% 有机溶剂（甲醇 MeOH、乙醇 EtOH、乙腈 MeCN）会使Tm降低 1-3℃，且变性能力排序为：MeOH<EtOH<MeCN（如 10 mM 醋酸铵缓冲液中，添加 20% MeOH 时Tm为 67.7℃，添加 20% MeCN 时降至 65.4℃）。

高浓度乙腈的影响：当MeCN 浓度升至 50% 时，siRNA 双链可能完全变性（如10 mM 醋酸铵 + 50% MeCN 中，DSC 未检测到熔融峰；25 mM 醋酸铵 + 50% MeCN 中，Tm仅为46.2℃，且双链难以复性）。

六氟异丙醇（HFIP）的特殊性：作为离子对色谱中常用的 MS 兼容溶剂，100 mM HFIP 对Tm影响较小，仅使Tm降低1-2℃（如10 mM TEA+缓冲液中，TEA/Ac 的Tm为56.6℃，TEA/HFIP的Tm为 54.9℃）。

体积排阻色谱（SEC）：Tm与DSC接近，受稀释影响略低

SEC基于分子大小分离，流动相（25 mM磷酸钠缓冲液）与固定相无显著相互作用，测得的Tm约70℃，与DSC 测得的74.8℃接近。

差异原因：SEC中样品被流动相稀释，导致双链稳定性略有下降；且色谱过程中存在柱上缓慢熔融，使Tm略低于溶液中的真实值。

图5. 采用含25 mM 磷酸钠（pH 7.5）的流动相对siRNA进行SEC分析

图6. 采用10/100 mM HA/HFIP离子对体系、以甲醇为洗脱剂对siRNA进行IP RP LC分析

亲水相互作用色谱（HILIC）：Tm远高于预期，固定相水层起稳定作用

HILIC 使用高比例乙腈（初始梯度60% MeCN），但测得的Tm约为80℃，远高于DSC 测得的10 mM醋酸铵 + 60%MeCN 体系的预期值（推测<50℃），且 90℃时仍有残留双链。

原因解释：HILIC 固定相（酰胺柱）表面吸附形成“富水层”，该水层的含水量远高于流动相本体，为双链提供了稳定环境，抵消了高浓度乙腈的变性作用。

图7. 采用含10 mM乙酸铵和乙腈的流动相进行siRNA双链的HILIC分析

反相色谱（RP LC）：Tm远低于 DSC，固定相富乙腈层促变性

RP LC（C18 固定相）无离子对试剂时，即使在低温（10℃）或高缓冲浓度（50 mM醋酸铵）下，双链仍易变性；30℃时，10 mM醋酸铵流动相中，双链几乎完全解离为单链，与DSC 测得的68.1℃（10 mM醋酸铵）差异极大。

原因解释：C18 固定相表面吸附形成“富有机层”，该层乙腈浓度高于流动相，显著增强了对双链的变性作用；而添加离子对试剂后（IP RP LC），试剂吸附可破坏 “富有机层”，提升双链稳定性。

图8. 采用10 mM乙酸铵为流动相、0%至25%乙腈梯度进行siRNA双链的RP LC分析